影響高壓均質機破碎細胞的因素

高壓均質是生物製藥過程中*常見的細胞破碎方法。在均質機中進行裂解依賴於(yu) 將細胞漿液泵送通過限製性孔閥。懸浮在生物反應器步驟獲得的廢培養(yang) 基或緩衝(chong) 液中的細胞，通過產(chan) 品供應管線輸送到柱塞泵，其在*高可達>1,000 bar (14,500 psi)的壓力下將細胞漿液移動到均質機閥。一旦細胞被裂解，裂解液就會(hui) 流向熱交換器，以冷卻裂解過程中產(chan) 生的熱量。操作壓力每升高100 bar，溫度預計將升高約2.4℃。一旦裂解液通過熱交換器，它就會(hui) 通過產(chan) 品回流線退出均質機。裂解液可以送到下一個(ge) 處理步驟或循環到均質機進行再次處理。漿液被送入均質機的次數被稱為(wei) 通過次數（passes），並且對於(yu) 均質步驟通常不止一次。進行多次通過處理時，至少需要兩(liang) 個(ge) 容器：一個(ge) 包含初始進料漿液，另一個(ge) 收集前次通過的裂解液。為(wei) 了執行二次通過，用於(yu) **次通過的裂解液收集容器成為(wei) 用於(yu) **次通過的進料容器，並且原始進料容器用於(yu) 收集**次通過的裂解液。將進料冷卻到均質機是一種很好的做法，例如2-8°C，以確保裂解液的溫度在均質閥之後、熱交換器之前不會(hui) 導致產(chan) 品變性。因此，使用的兩(liang) 個(ge) 工藝容器通常都有夾套，以允許冷卻水流動。

有數種機製可能在高壓均質過程中促進裂解，主要包括液體(ti) 的剪切、對衝(chong) 擊環的衝(chong) 擊以及空化力，此外，湍流和通過閥的壓降也被認為(wei) 有影響。可以使用Hetherington等人提出的酵母均質模型來探討影響均質機性能的參數。它假設裂解過程遵循**動力學，這意味著從(cong) 細胞中釋放產(chan) 物的速率與(yu) 釋放產(chan) 物的量成正比。從(cong) 這個(ge) 假設出發，他們(men) 推導出了下麵的公式：

其中，Rp = 單位細胞質量釋放的產(chan) 物

Rmp = 單位細胞質量可釋放的產(chan) 物的*大量

K = 與(yu) 溫度相關(guan) 的經驗常數

Npasses = 懸浮液通過均質機的次數

P =壓力

α = 經驗確定常數

使用該公式作為(wei) 指導，可以了解在高壓均質機中影響裂解的參數。從(cong) 公式中可見，壓力和通過次數影響均質機運行期間釋放的產(chan) 物量，這是一個(ge) 關(guan) 鍵性能參數；具體(ti) 地說，隨著壓力和/或通過次數的增加，釋放的蛋白質量Rp也會(hui) 增加。這兩(liang) 個(ge) 工藝參數是直接可控的，需要在cGMP均質步驟的批生產(chan) 記錄中明確說明壓力範圍或目標通過次數。

有研究探索了壓力和通過次數對產(chan) 綠色熒光蛋白(GFP)的基因修飾大腸杆菌均質的影響，其在300 bar (=4,350 psi) 和900 bar (-13,050 psi)的壓力下運行了5次。每次通過後的裂解液離心，記錄上清液中GFP的濃度。如上述公式所預測的，更多的通過次數和更高的壓力會(hui) 導致更多產(chan) 物的釋放。在900 bar壓力條件下，液體(ti) 中的GFP的濃度約為(wei) 2.66 mg/mL，代表了該研究中可從(cong) E.Coli細胞提取的*大GFP量。

裂解程度是一個(ge) 重要的性能參數，用於(yu) 計算每次通過均質後釋放的產(chan) 物*高濃度的百分比，其可使用以下公式計算：

其中，C為(wei) 目標產(chan) 物成分的濃度，Co為(wei) 目標物的起始濃度，Cmax為(wei) 目標物在“無限”時間後的*大濃度。

具體(ti) 來說，在上述案例中，在900 bar的壓力下通過3次，大部分產(chan) 物就會(hui) 從(cong) 細胞中釋放出來；因此，對於(yu) cGMP生產(chan) ，批記錄說明書(shu) 將指定壓力設定點為(wei) 900 bar，範圍850-950 bar，並使用3次通過，因為(wei) 執行3次通過直接明確的，所以不需要說明範圍。大多數生產(chan) 型均質機都配備了自動壓力控製，因此900 bar設定點附近的範圍實際上取決(jue) 於(yu) 均質機保持設定點的能力。請注意，操作超過3次通過不僅(jin) 對產(chan) 品回收沒有好處，而且會(hui) 產(chan) 生**後果，例如增加處理時間和降低細胞碎片的大小，使後續澄清步驟更具挑戰性。在前麵提到的研究中，該E.Coli/GFP係統的數據表明，壓力高於(yu) 900 bar並不會(hui) 在更少的通過次數下導致更多產(chan) 物的釋放。其它數據也表明，通過次數和壓力會(hui) 影響生物藥的活性，即可將液體(ti) 中的產(chan) 物活性作為(wei) 除產(chan) 物濃度之外的性能指標，這將更完整地表征均質步驟，並允許選擇確保對產(chan) 品質量沒有負麵影響的工藝參數值。

除壓力和通過次數外，其它參數也會(hui) 影響均質過程的性能。包括：

進料溫度。前述公式中的經驗參數K隨溫度升高而增大。因此，通常可以通過提高漿液送入均質機的溫度來改善裂解程度；然而，這樣做會(hui) 對產(chan) 物造成風險，因為(wei) 增加均質機進料的溫度會(hui) 導致漿液通過均質閥之後更高的溫度，這可能導致產(chan) 物變性。

細胞類型。參數α和K以及裂解的程度，取決(jue) 於(yu) 細胞的類型。與(yu) 細胞壁較薄的革蘭(lan) 氏陰性菌(如E.Coli)相比，具有較厚細胞壁的酵母更難裂解。但在生物製藥工藝中，所使用的細胞係是工藝設計的一部分，不能在直接控製。

其它因素。生物反應器收獲時細胞的生長階段、生長培養(yang) 基的組成、均質機和均質閥的設計都會(hui) 影響單次通過後的裂解程度。

此外，一項使用E.Coli進行的研究發現，均質機進料中的細胞濃度對均質機中細胞裂解的程度隻有很小的影響。均質機的性能可以用間接或直接的方法來定量。前麵已經介紹了作為(wei) 性能參數的產(chan) 物釋放量和裂解程度。兩(liang) 者都是測量均質機性能的間接方法。相比之下，計算被破壞細胞的數量被認為(wei) 是一種直接的方法。定量胞內(nei) 產(chan) 物釋放的方法雖然被歸類為(wei) 間接方法，但它的優(you) 點是為(wei) “從(cong) 細胞中回收多少生物製藥產(chan) 品”這個(ge) 問題提供了直接的答案，這是進行工藝設計時需要解答的問題。

完成一個(ge) 均質步驟所需的時間可以通過使用傳(chuan) 輸到設備的總體(ti) 積和單位體(ti) 積流速的比率來計算，前者必須考慮到不止一次通過的可能性：

其中，Vfeed為(wei) 單次均質機通過的進樣漿液的體(ti) 積（L），Npasses為(wei) 通過次數，Q為(wei) 通過均質機的單位體(ti) 積流速（L/h）。Vfeed根據工藝要求確定。需要的通過次數根據研究確定，以使用獲得*高產(chan) 物回收所需的通過次數。Q取決(jue) 於(yu) 所使用的高壓均質機的操作壓力和尺寸。供應商一般可提供給定均質機型號操作壓力和流速的相關(guan) 數據。

使用高壓均質機進行細胞裂解操作時，先按說明設置好均質機，然後將漿液細胞送入該裝置，可能需要多次通過才能完全裂解細胞。然後用緩衝(chong) 液衝(chong) 洗高壓均質機，並將回收的緩衝(chong) 液添加回*終裂解液中，以捕獲留在裝置滯留體(ti) 積中的任何殘留產(chan) 品。然後立即使用經過驗證的方法對係統進行清洗和**。特定設備會(hui) 有針對性的清潔解決(jue) 方案建議，一般 0.5 M NaOH較為(wei) 常見。然後用高純度水衝(chong) 洗均質機，以去除殘留的清潔/**劑，並幹燥儲(chu) 存設備。

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高壓均質是生物製藥生產(chan) 中*常用的機械裂解方法，具有良好的可放大性，且不需要添加額外的試劑。開發研究應側(ce) 重於(yu) 規定操作壓力的範圍和通過次數，以確保*大的回收率，且不會(hui) 使產(chan) 品變性或產(chan) 生在隨後的澄清步驟中無法去除的細胞碎片。每種產(chan) 品的允許範圍應包括在批生產(chan) 記錄中。